電泳及電泳設備解析

添加時間：2016/10/5 13:57:00

電泳設備：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳 (electrophoresis, EP)。
　　名詞解釋:
　　電泳：帶電荷的蛋白質或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象
什么是電泳
　　溶液中帶電粒子（離子）在電場中移動的現(xiàn)象。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。1937 年瑞典學者 A.W.K.蒂塞利烏斯設計制造了移動界面電泳儀 ，分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白，創(chuàng)建了電泳技術。
　　在確定的條件下，帶電粒子在單位電場強度作用下，單位時間內移動的距離（即遷移率）為常數(shù)，是該帶電粒子的物化特征性常數(shù)[1]。不 同帶電粒子因所帶電荷不同，或雖所帶電荷相同但荷質比不同，在同一電場中電泳，經一定時間后，由于移動距離不同而相互分離。分開的距 離與外加電場的電壓與電泳時間成正比。
　　在外加直流電源的作用下，膠體微粒在分散介質里向陰極或陽極作定向移動，這種現(xiàn)象叫做電泳。利用電泳現(xiàn)象使物質分離，這種技術也 叫做電泳。膠體有電泳現(xiàn)象，證明膠體的微粒帶有電荷。各種膠體微粒的本質不同，它們吸附的離子不同，所以帶有不同的電荷。利用電泳可 以確定膠體微粒的電性質，向陽極移動的膠粒帶負電荷，向陰極移動的膠粒帶正電荷。一般來講，金屬氫氧化物、金屬氧化物等膠體微粒吸附 陽離子，帶正電荷；非金屬氧化物、非金屬硫化物等膠體微粒吸附陰離子，帶負電荷。因此，在電泳實驗中，氫氧化鐵膠體微粒向陰極移動， 三硫化二砷膠體微粒向陽極移動。利用電泳可以分離帶不同電荷的溶膠。例如，陶瓷工業(yè)中用的粘土，往往帶有氧化鐵，要除去氧化鐵，可以 把粘土和水一起攪拌成懸浮液，由于粘土粒子帶負電荷，氧化鐵粒子帶正電荷，通電后在陽極附近會聚集出很純凈的粘土。工廠除塵也用到電 泳。利用電泳還可以檢出被分離物，在生化和臨床診斷方面發(fā)揮重要作用。本世紀40年代末到50年代初相繼發(fā)展利用支持物進行的電泳，如濾 紙電泳，醋酸纖維素膜電泳、瓊脂電泳；50年代末又出現(xiàn)淀粉凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等。目前，電泳技術已廣泛應用于分析化學、生 物化學、臨床化學、藥理學、免疫學、微生物學、遺傳學等科學中。
電泳種類
　　按分離原理的不同，電泳分為 4類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳和等速電泳（見圖）。
　?、僖苿咏缑骐娪臼菍⒈环蛛x的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負極），在電泳開始前，樣品與載體電解質有清晰的界面。 電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動，泳動速度快的離子走在前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有 第一個區(qū)帶的界面是清晰的，達到完全分離，其中含有電泳速度快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊（圖a）。
　　②區(qū)帶電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或 正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶（ 圖b ）。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳 、凝膠電泳與絲線電泳。
　?、鄣入娋劢闺娪臼菍尚噪娊赓|加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其 處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電 點的物質最后聚焦在各自等電點位置 ，形成一個個清晰的區(qū)帶（ 圖c ），分辨率極高。
　?、艿人匐娪臼窃跇悠分屑佑蓄I先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的小），樣品加在領先 離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進行移動，經過一段時間電泳后，達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排 列在領先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當?shù)闹С蛛娊赓|來載帶電流 ，所得到的區(qū)帶是相互連接的（圖d），且因“ 自身校正” 效應，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。
　　電泳分離原理示意圖 a 移動界面電泳 b 區(qū)帶電泳 c 等電聚焦電泳 d 等速電泳 L 領先離子 T 終末離子
應用
　　電泳已日益廣泛地應用于分析化學、生物化學、臨床化學、毒劑學、藥理學、免疫學、微生物學、食品化學等各個領域。在直流電場中， 帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electropho-resis）。1809年俄國物理學家Peнce首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，但直到1937年瑞 典的Tiselius建立了分離蛋白質的界面電泳（boundary electrophoresis）之后，電泳技術才開始應用。本世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯酰 胺凝膠等介質相繼引入電泳以來，電泳技術得以迅速發(fā)展。豐富多彩的電泳形式使其應用十分廣泛。電泳技術除了用于小分子物質的分離分析 外，主要用于蛋白質、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由于某些電泳法設備簡單，操作方便，具有高分辨率及選擇性特點，已成為醫(yī)學 檢驗中常用的技術。
　　電泳又名 —— 電著 ( 著 ) ，泳漆，電沉積。創(chuàng)始于二十世紀六十年代，由福特汽車公司應用于汽車底漆。由于其出色的防腐、防 銹功能，很快在軍工行業(yè)得到廣泛應用。近幾年才應用到日用五金的表面處理。由于其優(yōu)良的素質和高度環(huán)保，正在逐步替代傳統(tǒng)油漆噴涂。 　　電泳原理：
　　電泳是電泳涂料在陰陽兩極，施加于電壓作用下，帶電荷之涂料離子移動到陰極，
　　并與陰極表面所產生之堿性作用形成不溶解物，沉積于工件表面。
　　它包括四個過程：
　　1 ）電解（分解）
　　在陰極反應為電解反應，生成氫氣及氫氧根離子 OH ，此反應造成陰極面形成
　　一高堿性邊界層，當陽離子與氫氧根作用成為不溶于水的物質，涂膜沉積，方程式
　　為： H2O→OH+H
　　2 ）電泳動（泳動、遷移）
　　陽離子樹脂及 H+ 在電場作用下，向陰極移動，而陰離子向陽極移動過程。
　　3 ）電沉積（析出）
　　在被涂工件表面，陽離子樹脂與陰極表面堿性作用，中和而析出不沉積物，沉
　　積于被涂工件上。
　　4 ）電滲（脫水）
　　涂料固體與工件表面上的涂膜為半透明性的，具有多數(shù)毛細孔，水被從陰極涂
　　膜中排滲出來，在電場作用下，引起涂膜脫水，而涂膜則吸附于工件表面，而
　　完成整個電泳過程。
　　? 電泳表面處理工藝的特點：
　　電泳漆膜具有涂層豐滿、均勻、平整、光滑的優(yōu)點，電泳漆膜的硬度、附著力、
　　耐腐、沖擊性能、滲透性能明顯優(yōu)于其它涂裝工藝。
　　電泳
　　電泳(Electrophoresis)是指帶電荷的粒子或分子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳.大分子的蛋白質,多肽,病毒粒子,甚至細胞或小分子的氨基 酸,核苷等在電場中都可作定向泳動.1937年Tiselius成功地研制了界面電泳儀進行血清蛋白電泳,它是在一U型管的自由溶液中進行的,電泳后用 光學系統(tǒng)使各種蛋白所形成折光率差別成為曲線圖象,將血清蛋白分為白蛋白,α1-球蛋白,α2-球蛋白,β-球蛋白和γ-球蛋白五種,隨 后,Wielamd 和Kanig 等于1948年采用濾紙條做載體,同軸電纜成功地進行了紙上電泳.從那 時起,電泳技術逐漸被人們所接受并予以重視,繼而發(fā)展以濾紙,各種纖維素粉,淀粉凝膠,瓊脂和瓊脂糖凝膠,醋酸纖維素薄膜,聚丙烯酰胺凝膠等 為載體,結合增染試劑如銀氨染色,考馬斯亮藍等大大提高和促進生物樣品著色與分辨能力,此外電泳分離和免疫反應相結合,使分辨率不斷朝著 微量和超微量(1ng～0.001ng)水平發(fā)展,從而使電泳技術獲得迅速推廣和應用.在此主要介紹常用電泳的一般原理及其應用.
　　(一)電泳的基本原理
　　生物大分子如蛋白質,核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團,稱為兩性離子.常以顆粒分散在溶液中,它們的靜電荷取決于介質的H+濃度 或與其他大分子的相互作用.在電場中,帶電顆粒向陰極或陽極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號,這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳.
　　如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中,使顆粒具有恒定遷移速率的驅動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E.它們 與介質的摩擦阻力f抗衡.在自由溶液中這種抗衡服從Stokes定律.
　　F=6πrvη
　　這里v是在介質粘度為η中半徑為r的顆粒的移動速度.但在凝膠中,這種抗衡并不完全符合Stokes定律.F取決于介質中的其他因子,如凝膠厚 度,顆粒大小,甚至介質的內滲等.
　　電泳遷移率(mbility)m規(guī)定為在電位梯度E的影響下,顆粒在時間t中的遷移距離d.
　　d
　　m= ------------ 或 m=V / E
　　t·E
　　遷移率的不同提供了從混合物中分離物質的基礎,遷移距離正比于遷移率.
　　(二)影響電泳的因素
　　1. 電泳介質的pH值
　　溶液的pH值決定帶電物質的解離程度,也決定物質所帶凈電荷的多少.對蛋白質,氨基酸等類似兩性電解質,pH值離等電點越遠,粒子所帶電荷 越多,泳動速度越快,反之越慢.因此,當分離某一種混合物時,應選擇一種能擴大各種蛋白質所帶電荷量差別的pH值,以利于各種蛋白質的有效分 離.為了保證電泳過程中溶液的pH值恒定,必須采用緩沖溶液.
　　緩沖液的離子強度
　　溶液的離子強度(Ion intensity)是指溶液中各離子的摩爾濃度與離子價數(shù)平方的積的總和的1/2.帶電顆粒的遷移率與離子強度的平方根成 反比.低離子強度時,遷移率快,但離子強度過低,緩沖液的緩沖容量小,不易維持pH恒定.高離子強度時,遷移率慢,但電泳譜帶要比低離子強度時 細窄.通常溶液的離子強度在0.02～0.2之間.
　　I=1/2∑CiZi2 (I:離子強度;Ci:離子的摩爾濃度;Zi:離子價數(shù). )
　　0.154M NaCl溶液的離子強度為:
　　I= 1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154
　　0.015M Na2SO4溶液的離子強度為:
　　I= 1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045
　　3. 電場強度
　　電場強度(電勢梯度Electric field intensity)是指每厘米的電位降(電位差或電位梯度).電場強度對電泳速度起著正比作用,電場強度越 高,帶電顆粒移動速度越快.根據實驗的需要,電泳可分為兩種:一種是高壓電泳,所用電壓在500～1000V或更高.由于電壓高,電泳時間短(有的樣 品需數(shù)分鐘),適用于低分子化合物的分離,如氨基酸,無機離子,包括部分聚焦電泳分離及序列電泳的分離等.因電壓高,產熱量大,必須裝有冷卻 裝置,否則熱量可引起蛋白質等物質的變性而不能分離,還因發(fā)熱引起緩沖液中水分蒸發(fā)過多,使支持物(濾紙,薄膜或凝膠等)上離子強度增加,以 及引起虹吸現(xiàn)象(電泳槽內液被吸到支持物上)等,都會影響物質的分離.另一種為常壓電泳,產熱量小,室溫在10～25℃分離蛋白質標本是不被破 壞的,無需冷卻裝置,一般分離時間長.
　　4. 電滲現(xiàn)象
　　在電場中液體對于一個固體的固定相相對移動稱為電滲.在有載體的電泳中,影響電泳移動的一個重要因素是電滲.常遇到的情況是γ-球 蛋白,由原點向負極移動,這就是電滲作用所引起的倒移現(xiàn)象.產生電滲現(xiàn)象的原因是載體中常含有可電離的基團,如濾紙中含有羥基而帶負電荷, 與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷,液體便向負極移動.由于電滲現(xiàn)象往往與電泳同時存在,所以帶電粒子的移動距離也受電滲影響;如電泳方向與 電滲相反,則實際電泳的距離等于電泳距離加上電滲的距離.瓊脂中含有瓊脂果膠,,其中含有較多的硫酸根,所以在瓊脂電泳時電滲現(xiàn)象很明顯, 許多球蛋白均向負極移動.除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時,電滲大為減弱.電滲所造成的移動距離可用不帶電的有色染料或有色葡聚 糖點在支持物的中心,以觀察電滲的方向和距離.
　　(三)電泳的分類
　　目前所采用的電泳方法,大致可分為3類:顯微電泳,自由界面電泳和區(qū)帶電泳.區(qū)帶電泳應用廣泛,區(qū)帶電泳可分為以下幾種類型:
　　按支持物的物理性狀不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)濾紙為支持物的紙電泳;
　　(2)粉末電泳: 如纖維素粉,淀粉,玻璃粉電泳;
　　(3)凝膠電泳:如瓊脂,瓊脂糖,硅膠,淀粉膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳;
　　(4)緣線電泳:如尼龍絲,人造絲電泳
　　2. 按支持物的裝置形式不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)平板式電泳:支持物水平放置,是常用的電泳方式;
　　(2)垂直板電泳:聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳.
　　(3)柱狀(管狀)電泳:聚丙烯酰胺凝膠可灌入適當?shù)碾娪竟苤凶龀晒軤铍娪?
　　3.按pH的連續(xù)性不同,區(qū)帶電泳可分為:
　　(1)連續(xù)pH電泳:如紙電泳,醋酸纖維素薄膜電泳;
　　(2)非連續(xù)pH電泳:如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳;
　　(四)電泳所需的儀器
　　電泳所需的儀器有:電泳槽和電源.
　　1. 電泳槽
　　電泳槽是電泳系統(tǒng)的核心部分,根據電泳的原理,電泳支持物都是放在兩個緩沖液之間,電場通過電泳支持物連接兩個緩沖液,不同電泳采用 不同的電泳槽.常用的電泳槽有:
　　(1)圓盤電泳槽:有上,下兩個電泳槽和帶有鉑金電極的蓋.上槽中具有若干孔,孔不用時,用硅橡皮塞塞住.要用的孔配以可插電泳管(玻璃管) 的硅橡皮塞.電泳管的內徑早期為5～7mm,為保證冷卻和微量化,現(xiàn)在則越來越細.
　　(2)垂直板電泳槽:垂直板電泳槽的基本原理和結構與圓盤電泳槽基本相同.差別只在于制膠和電泳不在電泳管中,而是在塊垂直放置的平行 玻璃板中間.
　　(3)水平電泳槽:水平電泳槽的形狀各異,但結構大致相同.一般包括電泳槽基座,冷卻板和電極.
　　電源
　　要使荷電的生物大分子在電場中泳動,必須加電場,且電泳的分辨率和電泳速度與電泳時的電參數(shù)密切相關.不同的電泳技術需要不同的電壓 ,電流和功率范圍,所以選擇電源主要根據電泳技術的需要.如聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS電泳需要200～600V電壓.
　　(五)電泳技術的應用
　　1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質純度的鑒定.聚丙烯酰胺凝膠電泳同時具有電荷效應和分子篩效應,可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量 電荷的物質分離開,并且還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質分離開.其分辨率遠遠高于一般層析方法和電泳方法,可以檢出10-9～ 10-12g的樣品,且重復性好,沒有電滲作用.
　　2. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質分子量.其原理是帶大量電荷的SDS結合到蛋白質分子上克服了蛋白質分子原有電荷的影響而得到 恒定的荷/質比.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質分子量已經比較成功,此法測定時間短,分辨率高,所需樣品量極少(1～100μg),但只適用于球 形或基本上呈球形的蛋白質,某些蛋白質不易與SDS結合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此時測定結果就不準確.
　　3. 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于蛋白質定量.電泳后的凝膠經凝膠掃描儀掃描,從而給出定量的結果.凝膠掃描儀主要用于對樣品單向電泳后 的區(qū)帶和雙向電泳后的斑點進行掃描.
　　4.瓊脂或瓊脂糖凝膠免疫電泳可用于①檢查蛋白質制劑的純度;②分析蛋白質混合物的組分;③研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原 的抗體;④檢驗兩種抗原是否相同.
　　(六)電泳后結果檢測
　　對于不同的目的,應采用不同的檢測方法.用染料和生物大分子結合形成有色的復合物是電泳后檢測常用的方法.
　　(七)聚丙烯酰胺凝膠電泳結果不正?，F(xiàn)象和對策
　　1. 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上或向下的現(xiàn)象.向上的"微笑"現(xiàn)象說明凝膠的不均勻冷卻,中間部分冷卻不好,所以導致凝膠中分子有不同的遷 移率所致.這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時常發(fā)生.向下的"皺眉"現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的,特別是當凝 膠和玻璃板組成的"三明治"底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產生這種現(xiàn)象.
　　2."拖尾"現(xiàn)象是電泳中常見的現(xiàn)象.這常常是由于樣品溶解不佳引起的,克服的辦法是在加樣前離心,選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液 ,加增溶輔助試劑.另一方法是降低凝膠濃度.
　　3."紋理"現(xiàn)象常常是由于樣品中不溶顆粒引起的,克服辦法是增加溶解度和離心除去不溶性顆粒.
　　4. 蛋白帶偏斜常常是由于濾紙條或電極放置不平行所引起的,或由于加樣位置偏斜而引起.
　　5. 蛋白帶過寬,與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連,這是由于加樣量太多或加樣孔泄漏引起的.
　　6. 蛋白帶模糊不清和分辨不佳是由于多種原因引起的.雖然梯度凝膠可以提高分辨率,但與其他方法相比,常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳是分辨 率較低的方法.為了提高分辨率,不要加過多的樣品,小體積樣品可給出窄帶.加樣后應立即電泳,以防止擴散.選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充 分的分離.通?？拷把氐牡鞍讕Х直媛什患?所以應根據分子量與凝膠孔徑的關系,灌制足夠長度的凝膠,以使樣品不會走出前沿.樣品的蛋白水 解作用也引起擴散而使分辨率降低.水解作用通常發(fā)生在樣品準備的時候,系統(tǒng)中的內源性蛋白酶會水解樣品蛋白,如果在緩沖液中加蛋白酶抑制 劑可以減少這種情況的發(fā)生.